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Suporte Científico

Nosso time de Suporte Científico esclarece suas dúvidas técnicas sobre a utilização dos nossos Oligos e Sondas de DNA.

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Horário de atendimento: de segunda a sexta-feira, das 08h00 às 17h30, exceto em feriados nacionais.

Etapas da Produção e Qualidade
 

A ciência está no nosso DNA e levamos a sério o compromisso de apoiar o pesquisador oferecendo produtos de excelente qualidade e com preços competitivos.  Conheça abaixo nosso processo de produção e qualidade.

SÍNTESE

O processo de síntese dos oligos acontece em sintetizadoras automatizadas de alta tecnologia. Durante a produção, cada nucleotídeo é acoplado sequencialmente a partir da extremidade 3’.

QUALIDADE

Além de um processo de síntese minuciosamente controlado em sistema fechado, contamos com um segundo processo de checagem para garantir a qualidade dos seus oligos por meio de espectro de DNA em Nanodrop.

CLIVAGEM

Clivagem é a quebra da ligação da extremidade 3' do oligo ao suporte sólido e é feita por tratamento com hidróxido de amônio concentrado e agitação à temperatura de 80º C por duas horas.

SECAGEM

Os oligos sintetizados pela Exxtend são enviados secos, pois são altamente estáveis nessa forma. Ao receber os oligos, siga o protocolo da folha de dados para ressuspendê-los.

PURIFICAÇÃO

Devido a algumas características inerentes ao processo de síntese, o produto final terá, além dos oligos completos, sequências truncadas (incompletas), restos de reagentes, sais e subprodutos. Essas impurezas são removidas pela purificação.

ENVIO

A Exxtend orgulha-se de ter um prazo de produção e envio imbatível! Enviamos seus oligos padrão entre 2 e 3 dias úteis. Sondas e oligos purificados por HPLC são enviados entre 3 e 5 dias úteis.

 

SUPORTE E PÓS-VENDAS

Temos uma equipe multidisciplinar preparada para receber suas perguntas, dúvidas, sugestões ou reclamações! Entre em contato conosco pelo whatsapp, telefone ou e-mail.

SÍNTESE

A produção de oligos é realizada utilizando sintetizadores de DNA altamente eficientes, fabricados pela empresa alemã K&A Laborgeraete.

Estes equipamentos promovem a distribuição e o gerenciamento dos reagentes para todas as colunas de síntese durante cada adição de base até a sequência completa e são controlados por software que permite o monitoramento dos rendimentos de cada base.

 
Síntese de Oligos padrão

Oligo padrão é um fragmento de uma cadeia simples de DNA, podendo variar o número de bases nitrogenadas em sua sequência.

Na coluna de síntese, a primeira base nitrogenada A, C, G ou T do oligo na região 3’ está fixada em um suporte sólido de síntese (CPG), que é concebido para ancorar o crescimento da cadeia de DNA na reação. Assim, os oligos são sintetizados da região 3’ para 5’. O processo de síntese de um oligo consiste em uma série de reações químicas, de modo que cada base nitrogenada é acoplada sequencialmente à cadeia em crescimento, como pode ser visto no ciclo de síntese abaixo:

 As etapas de síntese de cada base são:

1 - Acoplamento: Uma base (Fosforamidita) é acoplada à hidroxila (OH) livre.

2 - Bloqueio: Caso a base não tenha acoplado devidamente, a hidroxila que não reagiu é bloqueada por acetilação, ficando inerte para
     reações subsequentes.

3 - Oxidação: Estabilização do grupo fosfato, evitando reações paralelas.

4 - Detritilação: Remoção do grupo de proteção 5'-DMT (4,4'-Dimetoxitritil) da extremidade do oligo, deixando uma hidroxila (OH) livre 
     para a próxima etapa.

5 - Clivagem e Desproteção: Clivagem da resina universal e remoção dos grupos de proteção. 

 

Também produzimos oligos degenerados, que apresentam misturas de duas ou mais bases diferentes em uma determinada posição dentro da sequência. O código de letras padrão para especificar uma degeneração é:

R = A+G                    Y = C+T                    B = C+G+T                    M = A+C                    K = G+T                   D = A+G+T               

S = C+G                    W = A+T                   H = A+C+T                    V = A+C+G               N = A+C+G+T         I = Inosina

Síntese de Oligos Marcados e Sondas
 

Marcação 5’: A marcação é feita ao término do ciclo de síntese, após a inserção da última base do oligo.

Modificação interna: A modificação é inserida da mesma forma que uma base nitrogenada durante o processo de síntese.

Marcação 3’: A marcação é incorporada ao suporte sólido de síntese (CPG) no início da síntese, antes da adição da primeira base.

A incorporação de uma marcação em um oligo pode ser realizada de maneiras diferentes, utilizando os grupos ativos das bases:

O ensaio TaqMan® utiliza um oligo duplamente marcado (sonda) para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados em uma PCR em tempo real. Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluoróforo e na outra um quencher ou supressor de fluorescência de tal modo que os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease da Taq DNA polimerase.

Quenchers Black Hole (BHQ) são quenchers sem fluorescência que atuam na sonda resultando numa menor fluorescência residual de fundo nos ensaios de PCR e ainda apresentam outras vantagens devido ao aumento de sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma maior opção de escolha de fluoróforos para ensaios de multiplexação, o que permite uma maior variedade de formulações de sondas.

 

BHQ-1 – É normalmente utilizado na faixa de 480-580 nm e pode ser usado em conjunto com os fluoróforos comumente aplicados como FAM, TET, HEX, CAL Flúor Orange entre outros.

 

BHQ-2 – Usado para faixa de 559-670 nm, e é mais eficaz em fluoróforos quenching como TAMRA, ROX, Cy3, Cy5, Quasar entre outros.

 

PURIFICAÇÃO
 

Devido a características inerentes do processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida, o produto final da síntese terá, além dos oligos completos, uma porcentagem de sequências truncadas (incompletas). Além dessas sequências truncadas, restos de reagentes, sais e subprodutos da síntese precisam ser removidos. Por isso, o tipo de purificação a ser escolhido é importante para garantir o grau de pureza que sua pesquisa precisa.

 

A Exxtend oferece três métodos de purificação a serem solicitados de acordo com as suas necessidades: Dessalinização, RP-OPC e HPLC.

Purificação por dessalinização
 

A coluna para dessalinização é composta de um gel poroso em que as partículas são separadas com base em seus tamanhos moleculares.

 

Na dessalinização são removidos sais e oligos incompletos pequenos, mas não são removidas as sequências truncadas de tamanho próximo ao do oligo, e por isso apenas uma parte da massa do oligo é composta pela sequência completa.

 

Os oligos dessalinizados são recomendados para várias aplicações, tais como genotipagem de bactérias, PCR e sequenciamento, porque as sequências incompletas presentes não afetarão os resultados consideravelmente.

Purificação por RP-OPC
 

O cartucho de purificação de oligos por fase reversa (Reverse-Phase Oligonucleotide Purification Cartridge) consiste em uma coluna preenchida por resina polimérica de alta performance.

 

O método baseia-se na forte ligação entre a resina e agrupamento DMT que é deixado na extremidade 5’ somente do oligo completo, separa os oligos com o sequenciamento completo (n) dos oligos incompletos que tiveram falha na síntese (n-1, n-2, ...) e os sais e impurezas. É similar à purificação HPLC, mas com menor grau de pureza e é indicada para PCR, qPCR, sequenciamento, microarray,  blotting, clonagem, entre outros.

 

Para algumas aplicações é fundamental estar presente apenas a sequência completa (n) do oligo. Para outros casos, a presença de oligos mais curtos (n-1, n-2, ...) não vai afetar os resultados.

 
Purificação por HPLC