Etapas da Produção e Qualidade
 

A ciência está no nosso DNA e levamos a sério o compromisso de apoiar o pesquisador oferecendo produtos de excelente qualidade e com preços competitivos.  Conheça abaixo nosso processo de produção e qualidade.

SÍNTESE

O processo de síntese dos oligos acontece em sintetizadoras automatizadas de alta tecnologia. Durante a produção, cada nucleotídeo é acoplado sequencialmente a partir da extremidade 3’.

QUALIDADE

Além de um processo de síntese minuciosamente controlado em sistema fechado, contamos com um segundo processo de checagem para garantir a qualidade dos seus oligos por meio de espectro de DNA em Nanodrop.

CLIVAGEM

Clivagem é a quebra da ligação da extremidade 3' do oligo ao suporte sólido e é feita por tratamento com hidróxido de amônio concentrado e agitação à temperatura de 80º C por duas horas.

SECAGEM

Os oligos sintetizados pela Exxtend são enviados secos, pois são altamente estáveis nessa forma. Ao receber os oligos, siga o protocolo da folha de dados para ressuspendê-los.

PURIFICAÇÃO

Devido a algumas características inerentes ao processo de síntese, o produto final terá, além dos oligos completos, sequências truncadas (incompletas), restos de reagentes, sais e subprodutos. Essas impurezas são removidas pela purificação.

ENVIO

A Exxtend orgulha-se de ter um prazo de produção e envio imbatível! Enviamos seus oligos padrão entre 2 e 3 dias úteis. Sondas e oligos purificados por HPLC são enviados entre 3 e 5 dias úteis.

 

SUPORTE E PÓS-VENDAS

Temos uma equipe multidisciplinar preparada para receber suas perguntas, dúvidas, sugestões ou reclamações! Entre em contato conosco pelo whatsapp, telefone ou e-mail.

SÍNTESE

A produção de oligos é realizada utilizando sintetizadores de DNA altamente eficientes, fabricados pela empresa alemã K&A Laborgeraete.

Estes equipamentos promovem a distribuição e o gerenciamento dos reagentes para todas as colunas de síntese durante cada adição de base até a sequência completa e são controlados por software que permite o monitoramento dos rendimentos de cada base.

 
Síntese de Oligos padrão

Oligo padrão é um fragmento de uma cadeia simples de DNA, podendo variar o número de bases nitrogenadas em sua sequência.

Na coluna de síntese, a primeira base nitrogenada A, C, G ou T do oligo na região 3’ está fixada em um suporte sólido de síntese (CPG), que é concebido para ancorar o crescimento da cadeia de DNA na reação. Assim, os oligos são sintetizados da região 3’ para 5’. O processo de síntese de um oligo consiste em uma série de reações químicas, de modo que cada base nitrogenada é acoplada sequencialmente à cadeia em crescimento, como pode ser visto no ciclo de síntese abaixo:

 As etapas de síntese de cada base são:

1 - Acoplamento: Uma base (Fosforamidita) é acoplada à hidroxila (OH) livre.

2 - Bloqueio: Caso a base não tenha acoplado devidamente, a hidroxila que não reagiu é bloqueada por acetilação, ficando inerte para
     reações subsequentes.

3 - Oxidação: Estabilização do grupo fosfato, evitando reações paralelas.

4 - Detritilação: Remoção do grupo de proteção 5'-DMT (4,4'-Dimetoxitritil) da extremidade do oligo, deixando uma hidroxila (OH) livre 
     para a próxima etapa.

5 - Clivagem e Desproteção: Clivagem da resina universal e remoção dos grupos de proteção. 

 

Também produzimos oligos degenerados, que apresentam misturas de duas ou mais bases diferentes em uma determinada posição dentro da sequência. O código de letras padrão para especificar uma degeneração é:

R = A+G                    Y = C+T                    B = C+G+T                    M = A+C                    K = G+T                   D = A+G+T               

S = C+G                    W = A+T                   H = A+C+T                    V = A+C+G               N = A+C+G+T         I = Inosina

Síntese de Oligos Marcados e Sondas
 

Marcação 5’: A marcação é feita ao término do ciclo de síntese, após a inserção da última base do oligo.

Modificação interna: A modificação é inserida da mesma forma que uma base nitrogenada durante o processo de síntese.

Marcação 3’: A marcação é incorporada ao suporte sólido de síntese (CPG) no início da síntese, antes da adição da primeira base.

A incorporação de uma marcação em um oligo pode ser realizada de maneiras diferentes, utilizando os grupos ativos das bases:

O ensaio TaqMan® utiliza um oligo duplamente marcado (sonda) para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados em uma PCR em tempo real. Esta sonda apresenta em uma extremidade um fluoróforo e na outra um quencher ou supressor de fluorescência de tal modo que os produtos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease da Taq DNA polimerase.

Quenchers Black Hole (BHQ) são quenchers sem fluorescência que atuam na sonda resultando numa menor fluorescência residual de fundo nos ensaios de PCR e ainda apresentam outras vantagens devido ao aumento de sobreposição espectral entre os corantes fluorescentes, permitindo uma maior opção de escolha de fluoróforos para ensaios de multiplexação, o que permite uma maior variedade de formulações de sondas.

 

BHQ-1 – É normalmente utilizado na faixa de 480-580 nm e pode ser usado em conjunto com os fluoróforos comumente aplicados como FAM, TET, HEX, CAL Flúor Orange entre outros.

 

BHQ-2 – Usado para faixa de 559-670 nm, e é mais eficaz em fluoróforos quenching como TAMRA, ROX, Cy3, Cy5, Quasar entre outros.

 

PURIFICAÇÃO
 

Devido a características inerentes do processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida, o produto final da síntese terá, além dos oligos completos, uma porcentagem de sequências truncadas (incompletas). Além dessas sequências truncadas, restos de reagentes, sais e subprodutos da síntese precisam ser removidos. Por isso, o tipo de purificação a ser escolhido é importante para garantir o grau de pureza que sua pesquisa precisa.

 

A Exxtend oferece três métodos de purificação a serem solicitados de acordo com as suas necessidades: Dessalinização, RP-OPC e HPLC.

Purificação por dessalinização
 

A coluna para dessalinização é composta de um gel poroso em que as partículas são separadas com base em seus tamanhos moleculares.

 

Na dessalinização são removidos sais e oligos incompletos pequenos, mas não são removidas as sequências truncadas de tamanho próximo ao do oligo, e por isso apenas uma parte da massa do oligo é composta pela sequência completa.

 

Os oligos dessalinizados são recomendados para várias aplicações, tais como genotipagem de bactérias, PCR e sequenciamento, porque as sequências incompletas presentes não afetarão os resultados consideravelmente.

Purificação por RP-OPC
 

O cartucho de purificação de oligos por fase reversa (Reverse-Phase Oligonucleotide Purification Cartridge) consiste em uma coluna preenchida por resina polimérica de alta performance.

 

O método baseia-se na forte ligação entre a resina e agrupamento DMT que é deixado na extremidade 5’ somente do oligo completo, separa os oligos com o sequenciamento completo (n) dos oligos incompletos que tiveram falha na síntese (n-1, n-2, ...) e os sais e impurezas. É similar à purificação HPLC, mas com menor grau de pureza e é indicada para PCR, qPCR, sequenciamento, microarray,  blotting, clonagem, entre outros.

 

Para algumas aplicações é fundamental estar presente apenas a sequência completa (n) do oligo. Para outros casos, a presença de oligos mais curtos (n-1, n-2, ...) não vai afetar os resultados.

 
Purificação por HPLC

A Cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography) também baseia-se na afinidade entre oligos completos e a coluna. Entretanto, a HPLC vai ainda além da RP-OPC.

 

O método utiliza um gradiente de concentração do conteúdo hídrico do reagente, retirando progressivamente as impurezas de acordo com o quão hidrofóbicas elas são. O processo de purificação é controlado por espectroscopia, que permite que a concentração do produto puro seja feita através da coleta do pico desejado ou "corte de qualidade", assim conseguimos resgatar apenas os oligos completos, livres inclusive de restos de fluoróforos. 

 

Indicamos purificação por HPLC para sondas, oligos marcados, oligos longos e para fins que exigem oligos muito puros.

 
CONTROLE DE QUALIDADE

Nosso controle de qualidade garante aos nossos clientes um alto padrão na produção de oligos.

     - Os reagentes utilizados na produção são fornecidos por empresas internacionais de alta confiança.

     - Os processos são automatizados e todas as etapas são monitoradas por várias funções de controle.

Contamos com um processo duplo de checagem para garantir a qualidade de nossos oligos:

 

Check 01 -  O processo de síntese ocorre num sistema fechado e automatizado que possui monitores que detectam a reação química de detritilação antes da inserção de cada base, e assim nos indicam que as bases acoplaram devidamente e estão preparadas para receber a próxima.

Check 02 - Após as etapas de purificação ou dessalinização, todos os oligos são analisados para avaliar a pureza e a massa obtida através da leitura de densidade ótica (DO). São realizadas leituras de absorbância utilizando-se espectrofotômetros de última geração para obter um espectro completo e preciso do oligo que nos informa se eles estão puros, na quantidade solicitada pelo cliente, e se os fluoróforos estão acoplados.

O pico de absorbância do DNA é de 260 nm e uma amostra de DNA deve exibir a curva padrão em formato de sino com um único pico em 260 nm. Contaminantes como sais de amônio, polissacarídeos e alguns compostos orgânicos apresentam pico de absorbância em torno de 230 nm, por isso a razão 260/230 nm é utilizada para avaliar a contaminação por outros compostos, sendo o valor de referência de 1,8.

Todos os oligos são entregues com a folha de especificações que inclui: Nome do oligo, Sequência 5’ - 3’, DO, Volume de diluição em µL para obter 100 pmol/µL, Quantidade em µg e nmol, Temperatura de anelamento (Tm) e Peso Molecular (PM).

 

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