De fato, recomendamos que os oligos sejam ressuspendidos em TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) e não em TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), que é o utilizado na maioria das reações tamponadas com esse buffer. Isso porque, se por um lado o TE ajuda a manter o pH da solução constante e a prevenir a digestão do oligo por DNAses, por outro lado, o TE pode causar inibição da PCR devido à ação quelante do EDTA, caso esse reagente esteja em alta concentração. Assim chegamos a essa fórmula que irá proteger seus oligos e não irá inibir sua PCR. Cabe lembrar que a diluição da solução estoque para a concentração de trabalho deve sempre ser feita em água pura livre de DNAses.
Exxtend
8 de Dez de 2018
Discussão
Em nossa experiência, percebemos que isso geralmente ocorre devido à alguns fatores: 1) Desenho do primer, que pode gerar estruturas secundárias (hairpim, self-dimer, hetero-dimer), decorrentes da interação entre os primers. Essas estruturas vão se formando a cada ciclo, similar à amplificação do template e são bem pequenas, por isso não aparecem no gel. Isso pode ser evitado com um desenho cuidadoso dos primers e posterior análise individual dos primers, e em conjunto, em analisadores de oligos online. Verifique também a especificidade dos primers e possíveis off-targets. 2) Alta concentração dos primers, isso também favorece a formação de estruturas secundárias. Por isso, recomendamos que sempre que for fazer uma PCR com primers novos, realize um gradiente de concentração pela temperatura para avaliar a eficiência de reação dos primers. Para isso, utilize um "pool" do DNA (template) que será usado para a reação (em torno de 20 ng para DNA genômico) e alterne a temperatura (de 58°C, 60°C, 62°C e 64°C) e concentração dos primers de (1µM, 0.5µM, 0.25µM, 0.125µM e 0.0625µM). 3) Primer mal sintetizado e/ou purificado, isso também pode ocorrer, embora seja um pouco mais raro que os itens acima. Se na sua PCR há amplificação do produto (amplicon), é provável que esteja ocorrendo a formação de estruturas secundárias. Na literatura existem relatos de aditivos que podem ser utilizados na PCR para aumentar a especificidade e diminuir a formação de estruturas secundárias. Nesse caso seria interessante diminuir a quantidade de primer na PCR, aumentar a temperatura de anelamento da PCR, ou utilizar DMSO entre 3% e 7%. O DMSO deve ser adicionado diretamente na reação da PCR, portanto, se o volume final da reação é de 25µL, ao adicionar 0,75µL de DMSO (para ter a concentração de 3%), esse volume deve ser descontado do volume de água adicionado para completar 25µL. Com essas medidas deve haver aumento da especificidade do primer, aumentando consequentemente a quantidade de templates utilizados e diminuindo a formação dessas estruturas secundárias. Caso essas medidas não sejam suficientes, os primers devem ser redesenhados.