Existem diversos métodos para se calcular a Temperatura de Anelamento. Os valores fornecidos em nossa folha de dados são calculados pelos softwares de nossas sintetizadoras. A primeira forma apresentada é a chamada regra de conteúdo de GC. É um método para oligos curtos (20-25 bases). A segunda forma de calcular o Tm parece ser o método mais preciso e mais indicado para oligos mais longos. Contudo, cabe ressaltar que as fórmulas fornecem apenas uma estimativa da temperatura de anelamento, e o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Quando for utilizar um primer pela primeira vez, teste um gradiente de temperaturas. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 56°C, 58°C, 60°C, 62°C e 64°C para encontrar a temperatura ideal. Você pode ler mais a respeito e fazer seu próprio cálculo de Tm no seguinte link: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html