Minha folha de dados apresenta informações de diluição diferente do protocolo do meu laboratório.

Em nossa experiência, percebemos que isso geralmente ocorre devido à alguns fatores: 1) Desenho do primer, que pode gerar estruturas secundárias (hairpim, self-dimer, hetero-dimer), decorrentes da interação entre os primers. Essas estruturas vão se formando a cada ciclo, similar à amplificação do template e são bem pequenas, por isso não aparecem no gel. Isso pode ser evitado com um desenho cuidadoso dos primers e posterior análise individual dos primers, e em conjunto, em analisadores de oligos online. Verifique também a especificidade dos primers e possíveis off-targets. 2) Alta concentração dos primers, isso também favorece a formação de estruturas secundárias. Por isso, recomendamos que sempre que for fazer uma PCR com primers novos, realize um gradiente de concentração pela temperatura para avaliar a eficiência de reação dos primers. Para isso, utilize um "pool" do DNA (template) que será usado para a reação (em torno de 20 ng para DNA genômico) e alterne a temperatura (de 58°C, 60°C, 62°C e 64°C) e concentração dos primers de (1µM, 0.5µM, 0.25µM, 0.125µM e 0.0625µM). 3) Primer mal sintetizado e/ou purificado, isso também pode ocorrer, embora seja um pouco mais raro que os itens acima. Se na sua PCR há amplificação do produto (amplicon), é provável que esteja ocorrendo a formação de estruturas secundárias. Na literatura existem relatos de aditivos que podem ser utilizados na PCR para aumentar a especificidade e diminuir a formação de estruturas secundárias. Nesse caso seria interessante diminuir a quantidade de primer na PCR, aumentar a temperatura de anelamento da PCR, ou utilizar DMSO entre 3% e 7%. O DMSO deve ser adicionado diretamente na reação da PCR, portanto, se o volume final da reação é de 25µL, ao adicionar 0,75µL de DMSO (para ter a concentração de 3%), esse volume deve ser descontado do volume de água adicionado para completar 25µL. Com essas medidas deve haver aumento da especificidade do primer, aumentando consequentemente a quantidade de templates utilizados e diminuindo a formação dessas estruturas secundárias. Caso essas medidas não sejam suficientes, os primers devem ser redesenhados.

Talvez. Qual é o tamanho da banda amplificada no controle negativo? Tem o tamanho da banda amplificada no template, ou outro tamanho? Você mediu a concentração do primer antes de montar a reação? Se a concentração de primers na reação estiver muito alta, eles podem formar dímeros. Reduza a concentração dos primers na reação e repita a PCR. Caso a banda persista, se ela for do mesmo tamanho que a banda amplificada no template, é possível que tenha havido contaminação. Para evitar contaminações, siga nossas recomendações: - Esteja de luvas limpas e use apenas ponteiras, tubos e reagentes autoclavados ao manipular oligos; - Dissolva oligos e sondas em TE 1X [10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM (pH 7,5 - 8,0)], e as diluições das soluções de trabalho em água nuclease-free; - Faça alíquotas pequenas, de acordo com a sua demanda, de forma que sempre que precisar possa utilizar uma nova alíquota, evitando assim o frequente descongelamento/recongelamento e, principalmente, a contaminação do estoque.

Existem diversos métodos para se calcular a Temperatura de Anelamento. Os valores fornecidos em nossa folha de dados são calculados pelos softwares de nossas sintetizadoras. A primeira forma apresentada é a chamada regra de conteúdo de GC. É um método para oligos curtos (20-25 bases). A segunda forma de calcular o Tm parece ser o método mais preciso e mais indicado para oligos mais longos. Contudo, cabe ressaltar que as fórmulas fornecem apenas uma estimativa da temperatura de anelamento, e o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Quando for utilizar um primer pela primeira vez, teste um gradiente de temperaturas. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 56°C, 58°C, 60°C, 62°C e 64°C para encontrar a temperatura ideal. Você pode ler mais a respeito e fazer seu próprio cálculo de Tm no seguinte link: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html