Um parâmetro importante para os iniciadores é a temperatura de anelamento (Tm = melting temperature). As temperaturas de anelamento razoáveis variam entre 55 °C a 70 °C. As temperaturas de calcinação estão, em média, cerca de 5 °C abaixo da Tm dos primers. Como a maioria das fórmulas fornecem um valor Tm estimada, a temperatura de anelamento é apenas um ponto de partida. Portanto, o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Se o experimento não produzir resultados esperados, recomenda-se testar um gradiente de temperatura. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 56°C, 58°C, 60°C, 62°C e 64°C para encontrar a temperatura ideal.