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Suporte Científico

Nosso time de Suporte Científico esclarece suas dúvidas técnicas sobre a utilização dos nossos Oligos e Sondas de DNA.

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Horário de atendimento: de segunda a sexta-feira, das 08h00 às 17h30, exceto em feriados nacionais.

Primers padrão ou degenerados

Oligos (= primers, = oligonucleotideos, = iniciadores) são fragmentos curtos de uma cadeia simples de ácido nucleico, geralmente com cerca de 20 bases nitrogenadas. São utilizados para os mais diversos fins na pesquisa científica e diagnóstica como análises quantitativas de microssatélites, expressão gênica, quantificações virais, metilação, mutações e polimorfismos, imagens in vivo de processos celulares, monitoramento de rejeição de transplantes, diagnóstico pré-natal e de processos carcinogênicos entre muitas outras finalidades.

 

Podem ser marcados com moléculas especiais e usados como sondas na detecção de sequências alvo.

 

A produção de oligos inicia-se pela extremidade 3’com a adição das bases nitrogenadas em um suporte sólido de síntese (Controlled Pore Glass - CPG). Assim, o sentido da síntese de oligos é 3’-5’, ao contrário de uma PCR. 

 
Recomendação

A qualidade de nossos oligos garante o funcionamento de sua PCR/qPCR, entretanto, recomendamos que se façam inicialmente reações de controle para verificação de suas funcionalidades antes de utilizá-los em procedimentos de rotina.


Se seu produto de PCR vai ser utilizado para posterior clonagem e expressão, é altamente recomendável que esse DNA seja sequenciado logo após a PCR, para garantir que a sequência a ser clonada esteja correta e para verificar se o próprio processo de amplificação pela polimerase não introduziu nenhum erro na sequência, que poderia levar à produção de uma proteína errada. Esse procedimento padrão faz com que o pesquisador tenha certeza da proteína que será expressa ao final do processo, sendo mínimos o tempo gasto e o material empregado.

 
Purificação por Dessalinização
 

A coluna para dessalinização é composta de um gel poroso em que as partículas são separadas com base em seus tamanhos moleculares. Na dessalinização são removidos sais e oligos incompletos pequenos, mas não são removidas as sequências truncadas de tamanho próximo ao do oligo completo. Oligos dessalinizados são utilizados em PCR convencionais, pois as sequências incompletas não afetarão os resultados.

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

 

Nota: Os oligos dessalinizados não apresentam sais e impurezas provenientes do processo de síntese e clivagem, porém podem apresentar sequências incompletas (truncadas) que levam a leituras artificialmente aumentadas de D.O. e podem interferir em algumas aplicações. Alguns procedimentos demandam purificação por dessalinização, embora para procedimentos mais complexos, recomenda-se a purificação RP-OPC ou HPLC, que apresentam um alto grau de pureza.

Purificação por RP-OPC

O cartucho de purificação de oligonucleotídeos por fase reversa (Reverse-Phase Oligonucleotide Purification Cartridge) consiste em uma coluna preenchida por resina polimérica de alta performance. O método baseia-se na forte ligação entre a resina e agrupamento DMT que é deixado na extremidade 5’ somente do oligo completo, permitindo assim a eliminação dos sais e impurezas mais comuns e também das sequências truncadas que não tem o grupo DMT. É similar à purificação HPLC, mas com menor grau de pureza e é indicada para PCR, qPCR, sequenciamento, microarray,  blotting, clonagem e outros.

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

 

Nota: Os oligos purificados com a tecnologia RP-OPC (Coluna de Purificação de Oligo por Fase Reversa), além de dessalinizados, não apresentam sequencias truncadas, deixando apenas os oligos completos.

 
Purificação por HPLC
 

A cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography) também baseia-se na afinidade entre oligos completos e a coluna. Entretanto, a HPLC vai ainda além da RP-OPC. O método utiliza um gradiente de concentração do conteúdo hídrico do reagente, retirando progressivamente as impurezas de acordo com o quão hidrofóbicas elas são. O processo de purificação é controlado por espectroscopia, assim conseguimos resgatar apenas os oligos completos, livres inclusive de restos de fluoróforos.  Indicamos purificação por HPLC para sondas, oligos marcados, oligos longos e para fins que exigem oligos muito puros.

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

 
Oligos marcados e Sondas

A incorporação de uma marcação em um oligo pode ser realizada de maneiras diferentes, utilizando os grupos ativos das bases.

Marcadores - Extremidade 3'

A Marcação 3’ é incorporada ao suporte sólido de síntese (CPG) no início da síntese, antes da adição da primeira base.

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

² Estes valores devem ser somados ao valor da sequência + o valor da purificação HPLC. 

  Recomendamos que os oligos marcados sejam purificados por HPLC.

Modificações Internas

A Modificação Interna é inserida da mesma forma que uma base nitrogenada durante o processo de síntese.

 

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

² Estes valores devem ser somados ao valor da sequência + o valor da purificação HPLC.

  Recomendamos que os oligos marcados sejam purificados por HPLC.

Marcadores - Extremidade 5'
 

A Marcação 5’ é feita ao término do ciclo de síntese, após a inserção da última base do oligo.

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

² Estes valores devem ser somados ao valor da sequência + o valor da purificação HPLC.

  Recomendamos que os oligos marcados sejam purificados por HPLC.

Marcações Substituíveis

Caso não tenha encontrado a marcação desejada, consulte abaixo as marcações substituíveis. 

¹ Dias uteis para produção, sem considerar o prazo de entrega dos Correios.

² Estes valores devem ser somados ao valor da sequência + o valor da purificação HPLC.

  Recomendamos que os oligos marcados sejam purificados por HPLC.