Rendimento Mínimo Garantido: que escala de síntese devo solicitar para receber a quantidade de oligo que preciso para o meu experimento?

Por que o rendimento final do meu oligo não é igual à escala de síntese?

A escala de síntese que você solicita (em nmol) é a quantidade de matéria no início da síntese. O rendimento final da síntese depende de diversos fatores. Para entender essa questão, vamos falar um pouquinho sobre como funciona a síntese de oligos! Você, que utiliza sondas e primers rotineiramente em seu laboratório, sabe como eles são feitos?

A síntese de oligos é um processo químico e cíclico, e o número de bases que você solicita em seu oligo, é o número de vezes que esse ciclo irá se repetir, sendo que a cada ciclo, uma base (fosforamidita) será adicionada. O processo tem início em uma fase sólida, uma resina, e é a massa de resina que entra na síntese que define a escala inicial do oligo!

 

Para que a síntese tenha início, o DMT, uma molécula protetora que bloqueia a resina contra reações cruzadas, precisa ser retirada. Isso ocorre na etapa chamada detritilação inicial. Essa etapa remove o DMT e deixa no lugar uma hidroxila (OH) livre, altamente reativa: o suporte sólido está prontinho para entrar no ciclo de síntese, que ocorre em 4 etapas:

Uma base se liga à hidroxila livre do suporte sólido de síntese. 

1 - Acoplamento

Caso a base não tenha acoplado, a molécula com a base faltante será bloqueada e não receberá nenhuma base nos próximos ciclos.

2 - Bloqueio

Já as moléculas que acoplaram bases corretamente, agora passam pela oxidação, processo que estabiliza o oligo em formação.

3 - Oxidação

A base recém acoplada também possui um DMT para evitar reações indesejadas. O DMT é retirado, deixando um OH livre para receber a próxima base.

4 - Detritilação

Após todos os ciclos de produção do seu oligo, ele precisa ser retirado do suporte sólido em que cresceu. Além disso, sua cadeia de fosfatos estará toda bloqueada, e precisa ser desprotegida, para que o oligo possa se anelar ao template quando você for utilizá-lo. Essas duas reações ocorrem na etapa 5 da figura acima (Clivagem e Desproteção).

 

Após a etapa de Clivagem e Desproteção, o oligo estará disponibilizado em solução, porém terá impurezas: sais, restos de reagentes, e oligos incompletos. Eles se formam porque a eficiência das reações químicas do acoplamento é de aproximadamente 99%-99,5%, o que significa que a cada ciclo, uma pequena porcentagem de moléculas não acopla a base corretamente e é bloqueada, não recebendo as bases subsequentes. Portanto, quanto maior for a sequência do oligo solicitado por você, mais oligos incompletos (truncados) serão formados. Esses sais, restos de reagentes, oligos truncados e outros subprodutos da síntese serão em seguida retirados na purificação. Temos três formas de purificação à sua escolha: dessalinização, RP-OPC e HPLC.

Após a purificação, o oligo passa pelo controle de qualidade, e em seguida é dosado e seco para ser enviado. Logo você receberá um tubinho com um pellet do seu oligo no fundo, pronto para ser hidratado e então fazer acontecer a mágica da biologia molecular!

Agora que você já entende o processo de fabricação de oligos, é fácil explicar os motivos de o rendimento final do não ser igual ao da escala de síntese:

1 - A eficiência de acoplamento não é de 100% e portanto uma pequena porcentagem da massa que entra no processo de síntese não acopla todas as bases;

2 - Além disso, sínteses mais complexas (com moléculas marcadoras, fluoróforos, ou em escalas de síntese maiores) também resultam em rendimentos finais um pouco menores;

3 - O processo de purificação, além de retirar os truncados, também geram em pequenas perdas. Quanto melhor a purificação, em mais perdas ela resulta;

4 - Retiramos uma pequena alíquota para os testes do controle de qualidade: é pouquinho, mas também resulta em perda no rendimento final.

 

Todas essas perdas são naturais do processo de síntese, e ocorrem aqui na Exxtend e em qualquer outra sintetizadora. Mas não se preocupe: as tabelas no início dessa página foram elaboradas para ajudar você a se organizar, solicitando a escala de síntese de acordo com a quantidade de oligos que você precisará para realizar seus experimentos.

Se tiver dúvidas, conte conosco, temos uma equipe preparada para te atender:

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Perguntas Relacionadas

Por que a eficiência de acoplamento afeta o rendimento da síntese?

 

A quantidade de oligos completos gerados na síntese depende da qualidade do processo e das propriedades inerentes ao método de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida. Aqui na Exxtend, procuramos maximizar a qualidade da síntese utilizando sempre reagentes de excelente qualidade, diluições frescas de amiditas, e fazendo sempre a manutenção das sintetizadoras automáticas. Entretanto, apesar de nossos esforços, a eficiência de acoplamento de bases em cada ciclo da síntese é de cerca de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, a quantidade de oligos completos sintetizado se dá pela fórmula 0.99^(n-1), sendo n o número de bases do oligo completo. Isso significa que após a síntese, um oligo de 20 bases terá 81,8% de sequências completas e 18,2% de sequências truncadas. Uma queda de apenas 1% na eficiência de acoplamento resultaria na redução desse rendimento para 66,8% de sequências completas e 33,2% de sequências truncadas. Assim, fica claro que a eficiência de acoplamento é muito importante para o rendimento da síntese, e é por isso que nossas sintetizadoras automáticas monitoram a eficiência de acoplamento a cada ciclo! 

Como é monitorada a eficiência da síntese?

Nossas sintetizadoras automáticas são programadas para monitorar a eficiência de acoplamento através da detecção da detritilação. Funciona assim: cada base que se acopla ao oligo em produção, vem protegida por um agrupamento DMT. Esse agrupamento é incolor, mas ao ser removido, gera uma coloração laranja. A intensidade dessa coloração é medida por espectrofotometria. Existe uma relação entre a absorbância detectada pelos monitores e a quantidade de moléculas de Tritil presentes. Assim, na detritilação, sabemos quantas bases acoplaram devidamente na fase de acoplamento.

Qual é o tamanho máximo que meu oligo pode ter?

Sintetizamos oligos de até 200 bases. Esse limite de tamanho deve-se a uma característica inerente ao processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida: a eficiência de cada ciclo da síntese é de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, a quantidade de oligos completos sintetizado se dá pela fórmula 0.99^(n-1), sendo n o número de bases do oligo completo. Assim, o ciclo de síntese de um primer de mais de 200 bases teria uma baixíssima eficiência, e não poderíamos garantir um oligo de excelente qualidade.

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