Perguntas Frequentes

A síntese de oligonucleotídeos se dá por meio de uma metodologia de adição das bases nitrogenadas (fosforamiditas) em sequência, em um suporte sólido de síntese. A síntese tem início em uma partícula de resina com ligante succinil protegido por um agrupamento DMT, que sofre a detritilação inicial: perde o DMT, ficando uma hidroxila livre, pronta para o acoplamento da primeira base. O ciclo sintético é composto de 4 fases: 1 - acoplamento: uma base (fosforamidita) é acoplada à hidroxila (OH) livre da resina, gerada pela saída do grupo DMT. Essa base, por sua vez, também tem em sua estrutura de carbonos um grupo DMT de proteção. 2 - bloqueio: o acoplamento da base (fosforamidita) não ocorre em 100% dos grupos OH livres e por isso faz-se necessário o bloqueio daquelas hidroxilas que não reagiram neste ciclo, por isso, a hidroxila que não reagiu é bloqueada por acetilação, ficando inerte para reações subseqüentes, gerando assim as chamadas sequências truncadas. Aquelas bases que tenham acoplado conforme esperado seguem para a próxima fase do ciclo. 3 - oxidação: trata-se da estabilização do grupo fosfato presente na estrutura do oligo, a fim de evitar reações paralelas entre o oligo em formação e os reagentes da síntese. 4 - detritilação: as bases devidamente acopladas, agora estabilizadas, perdem o tritil (DMT), ficando uma hidroxila livre, pronta para entrar novamente no ciclo e receber a próxima base. O número de ciclos para a produção de um oligo equivale ao número de bases na sequência do oligo em questão. A cada ciclo, uma base é acoplada. Ao fim dos ciclos, os oligos são clivados da resina em que estavam acoplados e recebem um tratamento de desproteção para que as bases estejam reativas no momento da PCR.

Sintetizamos oligos de até 199 bases. Esse limite de tamanho deve-se a uma característica inerente ao processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida: a eficiência de cada ciclo da síntese está em torno de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, o percentual de síntese, que define a quantidade de oligos completos sintetizados é calculado pela fórmula 0.99^(n-1), sendo “n” o número de bases do oligo completo. Assim, o ciclo de síntese de um primer de mais de 199 bases teria uma baixíssima eficiência, e não poderíamos garantir um oligo de excelente qualidade.

A quantidade de oligos completos gerados na síntese depende da qualidade do processo e das propriedades inerentes ao método de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida. Aqui na Exxtend, procuramos maximizar a qualidade da síntese utilizando sempre reagentes de excelente qualidade, diluições frescas de amiditas, e fazendo sempre a manutenção das máquinas sintetizadoras automáticas. Entretanto, apesar de nossos esforços, a eficiência de acoplamento de bases em cada ciclo da síntese é de cerca de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, a quantidade de oligos completos sintetizados se dá pela fórmula 0.99^(n-1), sendo n o número de bases do oligo completo. Isso significa que após a síntese, um oligo de 20 bases terá 81,8% de sequências completas e 18,2% de sequências truncadas. Uma queda de apenas 1% na eficiência de acoplamento, ou seja 98%, resultaria na redução desse rendimento para 66,8% de sequências completas e 33,2% de sequências truncadas. Assim, fica claro que a eficiência de acoplamento é muito importante para o rendimento da síntese, e é por isso que nossas máquinas sintetizadoras automáticas monitoram a eficiência de acoplamento a cada ciclo! Além disso, após a síntese os oligos são purificados por dessalinização, RP-OPC ou HPLC, e chegam ao cliente ótimos para o uso!

Nossas sintetizadoras automáticas são programadas para monitorar a eficiência de acoplamento através da detecção da detritilação. Funciona assim: cada base que se acopla ao oligo em produção, vem protegida por um agrupamento tritil, que é removido no processo para dar espaço para entrada da nova base. Esse agrupamento é incolor, mas ao ser removido, gera uma coloração laranja. A intensidade dessa coloração é medida por espectrofotometria. Existe uma relação entre a absorbância detectada pelos monitores e a quantidade de moléculas de tritil presentes. Assim, na detritilação, sabemos quantas bases acoplaram devidamente na fase de acoplamento.

Devido a características inerentes do processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida, o produto final da síntese terá, além dos oligos completos, uma porcentagem de sequências truncadas (incompletas). Além dessas sequências truncadas, restos de reagentes, sais e subprodutos da síntese precisam ser removidos. A Exxtend oferece três métodos de purificação a serem solicitados de acordo com as demandas da sua pesquisa: dessalinização, RP-OPC e HPLC.

Dessalinização: a coluna para dessalinização é composta de um gel poroso em que as partículas são separadas com base em seus tamanhos moleculares. Na dessalinização são removidos sais e oligos incompletos pequenos, mas não são removidas as sequências truncadas de tamanho próximo ao do oligo completo. Oligos dessalinizados são utilizados em amplificações simples e sequenciamentos, pois as sequências incompletas não afetarão os resultados. RP-OPC: o cartucho de purificação de oligonucleotídeos por fase reversa (Reverse-Phase Oligonucleotide Purification Cartridge) consiste em uma coluna preenchida por resina polimérica de alta performance. O método baseia-se na forte ligação entre a resina e o agrupamento DMT que é mantido na extremidade 5’ somente do oligo completo. Na presença de certos reagentes, ocorre a separação dos sais e impurezas mais comuns e também das sequências truncadas que não têm o grupo DMT (portanto não têm afinidade pela coluna). Em seguida são eluidos e recolhidos apenas os oligos completos. É similar à purificação HPLC, mas com menor grau de eficiência e, portanto de pureza, e é indicada para PCR, qPCR, sequenciamento, microarray, blotting e clonagem. HPLC: a cromatografia líquida de alta eficiência (high performance liquid chromatography) também baseia-se na afinidade entre oligos completos e a coluna. Entretanto, a HPLC vai ainda além da RP-OPC. O método utiliza gradiente de concentração do conteúdo hídrico dos reagentes, retirando progressivamente as impurezas de acordo com o quão hidrofóbicas elas são. O processo de purificação é controlado por espectrofotometria, assim conseguimos resgatar apenas os oligos completos, livres inclusive de restos de fluoróforos. Indicamos purificação por HPLC para sondas, oligos marcados, oligos longos e para fins que exigem oligos impecavelmente puros.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) e FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) são duas técnicas de cromatografia líquida com a mesma origem e a mesma finalidade: separar moléculas. Diferem no tamanho das moléculas que separam, nos tampões que utilizam e na pressão empregada. A FPLC geralmente é operada em pressões médias (até 5 bar), compatíveis com o seu principal uso, a separação de proteínas (embora seja também utilizada para a separação de muitas outras biomoléculas, inclusive oligonucleotídeos). A HPLC geralmente é operada com pressões bem maiores, e é compatível com moléculas tanto grandes quanto pequenas. Esse método é adequado para nossos oligos. A pressão que empregamos varia durante o processo cromatográfico, mas gira em torno de 20 bar em nossa rotina. Em resumo, o nome da cromatografia líquida varia de acordo com várias definições, mas o importante é conhecer muito bem as moléculas a serem separadas, para utilizar tampões e pressão adequadas.

A escala de síntese, dada em nanomoles (nmol), refere-se à capacidade de síntese da matriz, na qual o oligo será sintetizado, é aproximadamente a quantidade de material presente no início da síntese, e não a quantidade de produto final. Todas as máquinas sintetizadoras de oligos operam dessa forma pelo seguinte motivo: não é possível prever a quantidade final de oligos, pois a mesma depende de fatores intrínsecos ao método de síntese e de propriedades, características de cada oligo a ser sintetizado. Além disso, o manuseio do oligo após a síntese (clivagem, desproteção, purificação, checagem de qualidade) também gera pequenas perdas. A Exxtend garante um rendimento mínimo de síntese, quantificado em densidade óptica (D.O.), para que o cliente esteja seguro na hora de fazer o pedido de que terá o oligo na quantidade suficiente para sua pesquisa.

Depende da escala de síntese que você solicitou, e da concentração de trabalho que você utilizará em suas reações. Supondo que você pediu o oligo “exemplo_exxtend” purificado por RP-OPC, na escala de 10 nmol. Nosso lab enviou a você o oligo em D.O.= 2,8. A folha de dados informa que, dado a massa do oligo em questão, estamos enviando 10,4 nmol, e que essa massa deve ser dissolvida em 104 µL de TE para que o estoque esteja a 100 pmol/µL. Dado que uma PCR convencional geralmente utiliza 0,5 a 1 uL de primers na concentração usual de trabalho (10 pmol/µL) para um volume final de reação de 25 µL, e assumindo o uso do volume máximo (1 µL), seu oligo seria suficiente para aproximadamente 1040 reações.

Para auxiliar os clientes no desenho de suas sondas e no planejamento de seus experimentos, temos uma tabela com alguns dos principais aparelhos para PCR em tempo real e os fluoróforos compatíveis com cada um deles. Caso você tenha uma sonda já desenhada com fluoróforos que não constam em nosso Formulário de Cotação e Pedido, pode nos consultar sobre as possibilidades de substituição de fluoróforos!

Temos uma grande variedade de marcadores em nosso catálogo, possibilitando a substituição da maior parte dos marcadores indisponíveis. Além disso, buscamos continuamente a ampliação do nosso catálogo, portanto caso você não encontre uma substituição possível, pode entrar em contato conosco e indicar os marcadores que precisa. Faremos o possível para atendê-lo. No entanto, é preciso observar que diferentes marcadores possuem massas moleculares e propriedades físico-químicas distintas. Logo, ao substituir um marcador, analise se o oligo resultante atende às necessidades da sua pesquisa!

O método mais rápido e fácil é através deste site. Baixe o nosso Formulário de Cotação e Pedido, preencha com os dados obrigatórios e envie para o nosso email exxtend@exxtend.com.br.

Sim. Não há qualquer custo adicional para este serviço, sendo que qualquer combinação das bases A, G, C ou T pode ser utilizada. Os seguintes códigos são usados para indicar misturas: R = A+G, Y = C+T, M = A+C, K = G+T, S = C+G, W = A+T, B = C+G+T, D = A+G+T, H = A+C+T, V = A+C+G, N = A+C+G+T.

Os oligos sintetizados pela Exxtend são enviados secos, pois são altamente estáveis nessa forma. Após receber o oligo, por favor, centrifugue o tubo para ter certeza que algum oligo seco que desgrudou do tubo durante o envio seja retornado ao fundo do tubo. Para ressuspender (dissolver) o oligo utilize solução de tampão TE (10 mM tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Tris (tris(hidroximetil)aminometano) é um tampão que mantém constante o pH da solução. O EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) protege o DNA da digestão por nucleases. Deixe o oligo hidratar por alguns minutos com vórtex intermitente antes da quantificação. É importante notar que a diluição da solução estoque para a concentração de trabalho deve sempre ser feita em água pura livre de DNAses.

A Exxtend fornece uma folha de especificações dos oligos informando os dados quantitativos em nmoles, unidades de densidade óptica (DO), microgramas (µg) e o peso molecular (PM). Isso permite calcular a solução estoque por qualquer valor de concentração que você preferir. A regra geral estabelece que para qualquer oligo, o número de nmoles x 10 dará a quantidade de solvente, em microlitros, para obter solução de 100 µM (pmol/µL). Confira abaixo: Concentração molar x volume = n° de mol ou volume = n° de mol / concentração molar sendo [1 nmol = 1000 pmol] Portanto, Volume (em µL) = nmol x 1000 pmol / 100 µM (pmol/ µL) = nmol x 10 A folha de especificações dos oligos também apresenta o volume de diluição em µL, para concentração de 100 pmol/µL (µM). Utilizando esse volume de solução, seu oligo estará suspenso na concentração estoque (100 pmol/µL = 100 µM). Lembre-se que os oligos devem ser diluídos em solução TE (10 mM tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), e que a diluição dos mesmos para a concentração de trabalho (5-10 µM) deve ser feita em água pura livre de DNAses.

Primeiramente, prepare o tampão tris 1 M e o EDTA 0,5 M segundo os protocolos abaixo: Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) 1 M, pH = 8,0, volume = 1 L: Pesar 121,12 g de tris base, dissolver em volume menor que 1 L de água pura livre de DNAses, ajustar o pH para 8,0 com HCl 1 M e completar o volume a 1 L com água milli-Q. Preparo do EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) 0,5 M, pH = 8,0 em volume = 50 mL: pesar o EDTA (9,305 g, PM = 372,22), dissolver em volume menor que 50 mL de água milli-Q, ajustar o pH para 8,0 com NaOH concentrado e adicional água milli-Q em q.s.p. 50 mL. Esterilizar as soluções de EDTA e tampão tris antes de preparar a solução tampão TE 1X. Solução tampão TE 1X [10 mM tris-HCl contendo EDTA 0,1 mM (pH 7,5 - 8,0), volume = 500 mL). Juntar 5 mL de tris 1 M com 0,1 mL de EDTA 0,5 M + 494,9 mL de H2O Milli-Q. Armazene o TE 1X em temperatura ambiente em frasco fechado.

De fato, recomendamos que os oligos sejam ressuspendidos em TE (10 mM tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) e não em TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), que é o utilizado na maioria das reações tamponadas com esse tampão. Isso porque, se por um lado o TE ajuda a manter o pH da solução constante e a prevenir a digestão do oligo por DNAses, por outro lado, o TE pode causar inibição da PCR devido à ação quelante do EDTA, caso esse reagente esteja em alta concentração. Assim chegamos a essa fórmula que irá proteger seus oligos e não irá inibir sua PCR. Cabe lembrar que a diluição da solução estoque para a concentração de trabalho deve sempre ser feita em água pura livre de DNAses.

O oligo dissolvido em TE (50-100 µM) é estável durante pelo menos 6 meses a -20 °C ou 4 °C. O oligo dissolvido em água é estável por 6 meses a -20 °C na ausência de nucleases. Certifique-se que a água utilizada é de pH neutro para evitar depurinação. Não é recomendado armazenar os oligos em água a 4 °C. Alguns oligos modificados são menos estáveis e devem ser utilizados dentro de 3 meses para um desempenho ideal. Isso se aplica, em especial, para oligos marcados com Quasar. Todos os oligos marcados com corantes devem ser armazenados sob proteção da luz para evitar a fotodegradação. É recomendado evitar múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Não é recomendado guardar oligos diluídos (solução de trabalho a 5-10 µM) mesmo que congelados.

Oligos secos possuem enorme estabilidade. Entretanto, os oligos em solução apresentam prazo de validade mais finito. Para a maioria das situações, os oligos dissolvidos (soluções estoque) ainda devem funcionar bem, mesmo se tiverem permanecido à temperatura ambiente durante alguns dias. Entretanto, os oligos em concentração de trabalho (5-10 µM) não devem ser utilizados após permanecerem na bancada durante a noite.

Um parâmetro importante para os iniciadores é a Tm = melting temperature. As TMs razoáveis variam entre 55 a 70 °C. As temperaturas de anelamento estão, em média, cerca de 5 °C abaixo da Tm média dos primers. Como a maioria das fórmulas fornece valor de Tm estimada, a temperatura de anelamento é apenas um ponto de partida. Portanto, o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Se o experimento não produzir resultados esperados, recomenda-se testar um gradiente de temperatura. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C para encontrar a temperatura ideal.

Existem diversos métodos para se calcular a Tm. Os valores fornecidos em nossa folha de dados são calculados pelos softwares de nossas máquinas sintetizadoras. A primeira forma apresentada é a chamada regra de conteúdo de GC. É um método para oligos curtos (20-25 bases). A segunda forma de calcular o Tm parece ser o método mais preciso e mais indicado para oligos mais longos. Contudo, cabe ressaltar que as fórmulas fornecem apenas uma estimativa da Tm, que deve ser usado apenas como referência. Quando for utilizar um primer pela primeira vez, teste um gradiente de temperaturas. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 54°C 56°C, 58°C, 60°C, 62°C para encontrar a temperatura ideal. Você pode ler mais a respeito e fazer seu próprio cálculo de Tm no seguinte link: http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

Não se preocupe, essa conversão é bem simples: 1 pmol/µL = 1 µM.

Talvez. Qual é o tamanho da banda amplificada no controle negativo? Tem o tamanho da banda amplificada (amplicon) no template? Ou outro tamanho? Você mediu a concentração do primer antes de montar a reação? Se a concentração de primers na reação estiver muito alta, eles podem formar dímeros. Reduza a concentração dos primers na reação e repita a PCR. Caso a banda persista, se ela for do mesmo tamanho que a banda amplificada no template, é possível que haja contaminação. Faça novas diluições do primer. Para evitar contaminações, siga nossas recomendações: • Esteja de luvas limpas e use apenas ponteiras, tubos e reagentes esterilizados ao manipular oligos; • Dissolva oligos e sondas em TE 1X [10 mM trisHCl, EDTA 0,1 mM (pH 7,5 - 8,0)], e as diluições das soluções de trabalho em água nuclease-free; • Faça alíquotas pequenas, de acordo com a sua demanda, de forma que sempre que precisar possa utilizar uma nova alíquota, evitando assim o frequente descongelamento/recongelamento e, principalmente, a contaminação do estoque.

Em nossa experiência, percebemos que isso geralmente ocorre devido a alguns fatores: 1) Desenho do primer, que pode gerar estruturas secundárias (hairpim, self-dimer, hetero-dimer), decorrentes da interação entre os primers. Essas estruturas vão se formando a cada ciclo, similar à amplificação do template e geralmente são bem pequenas. Isso pode ser evitado com um desenho cuidadoso dos primers e posterior análise individual dos primers, e em conjunto, em analisadores de oligos online. Verifique também a especificidade dos primers e possíveis off-targets. 2) Alta concentração dos primers, isso também favorece a formação de estruturas secundárias. Por isso, recomendamos que sempre que for fazer uma PCR com primers novos, realize um gradiente de concentração x temperatura para avaliar a eficiência de reação dos primers. Para isso, utilize um "pool" do DNA (template) que será usado para a reação (em torno de 20 ng para DNA genômico) e alterne a temperatura (com a menor temperatura sempre 5°C abaixo da média dos TMs dos primers) e concentração dos primers de (1 µM, 0,5 µM, 0,25 µM, 0,125 µM e 0,0625 µM). 3) Primer mal sintetizado e/ou purificado, isso também pode ocorrer, embora seja um pouco mais raro que os itens acima. Se na sua PCR há amplificação do produto (amplicon), é provável que esteja ocorrendo a formação de estruturas secundárias. Na literatura existem relatos de aditivos que podem ser utilizados na PCR para aumentar a especificidade e diminuir a formação de estruturas secundárias. Nesse caso seria interessante diminuir a quantidade de primer na PCR, aumentar a temperatura de anelamento da PCR, ou utilizar DMSO entre 3% e 7%. O DMSO deve ser adicionado diretamente na reação da PCR, portanto, se o volume final da reação é de 25 µL, ao adicionar 0,75 µL de DMSO (para ter a concentração de 3%), esse volume deve ser descontado do volume de água adicionado para completar 25 µL. Com essas medidas deve haver aumento da especificidade do primer, aumentando consequentemente a quantidade de templates utilizados e diminuindo a formação dessas estruturas secundárias. Caso essas medidas não sejam suficientes, os primers devem ser redesenhados.