Perguntas Frequentes

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Como são feitos os oligos?


A Síntese de oligonucleotídeos se dá por meio de uma metodologia de adição de fosforamiditas (as bases nitrogenadas) em um suporte sólido de síntese. A síntese tem início em uma partícula de resina com ligante succinil protegido por um agrupamento DMT, que sofre a detritilação inicial: perde o DMT, ficando uma hidroxila livre, pronta para o acoplamento da primeira base. O Ciclo sintético é composto de 4 fases:

1 - Acoplamento: Uma base (fosforamidita) é acoplada à hidroxila (OH) livre da resina. Essa base, por sua vez, também tem em sua estrutura de carbonos um grupo DMT de proteção.

2 - Bloqueio: Caso a base não tenha acoplado devidamente, a hidroxila que não reagiu é bloqueada por acetilação, ficando inerte para reações subsequentes. Caso a base tenha acoplado conforme esperado, a molécula segue para a próxima fase do ciclo.

3 - Oxidação: Trata-se da estabilização do grupo fosfato presente na estrutura do oligo, a fim de evitar reações paralelas entre o oligo em formação e os reagentes da síntese

4 - Detritilação: As bases devidamente acopladas, agora estabilizadas, perdem o tritil (DMT), ficando uma hidroxila livre, pronta para entrar novamente no ciclo e receber a próxima base.

O número de ciclos para a produção de um oligo equivale ao número de bases na sequência do oligo em questão. A cada ciclo, uma base é acoplada. Ao fim dos ciclos, os oligos são clivados da resina em que estavam acoplados e recebem um tratamento para que as bases estejam reativas no momento da PCR.




Qual é o tamanho máximo que meu oligo pode ter?


Sintetizamos oligos de até 200 bases. Esse limite de tamanho deve-se a uma característica inerente ao processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida: a eficiência de cada ciclo da síntese é de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, a quantidade de oligos completos sintetizado se dá pela fórmula 0.99^(n-1), sendo n o número de bases do oligo completo. Assim, o ciclo de síntese de um primer de mais de 200 bases teria uma baixíssima eficiência, e não poderíamos garantir um oligo de excelente qualidade.




Por que a eficiência de acoplamento afeta o rendimento da síntese?


A quantidade de oligos completos gerados na síntese depende da qualidade do processo e das propriedades inerentes ao método de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida. Aqui na Exxtend, procuramos maximizar a qualidade da síntese utilizando sempre reagentes de excelente qualidade, diluições frescas de amiditas, e fazendo sempre a manutenção das sintetizadoras automáticas. Entretanto, apesar de nossos esforços, a eficiência de acoplamento de bases em cada ciclo da síntese é de cerca de 99%. Ao final de todos os ciclos de síntese, a quantidade de oligos completos sintetizado se dá pela fórmula 0.99^(n-1), sendo n o número de bases do oligo completo. Isso significa que após a síntese, um oligo de 20 bases terá 81,8% de sequências completas e 18,2% de sequências truncadas. Uma queda de apenas 1% na eficiência de acoplamento resultaria na redução desse rendimento para 66,8% de sequências completas e 33,2% de sequências truncadas. Assim, fica claro que a eficiência de acoplamento é muito importante para o rendimento da síntese, e é por isso que nossas sintetizadoras automáticas monitoram a eficiência de acoplamento a cada ciclo! Além disso, após a síntese os oligos são purificados por dessalinização, RP-OPC ou HPLC, e chegam ao cliente ótimos para o uso!




Como é monitorada a eficiência da síntese?


Nossas sintetizadoras automáticas são programadas para monitorar a eficiência de acoplamento através da detecção da detritilação. Funciona assim: cada base que se acopla ao oligo em produção, vem protegida por um agrupamento Tritil. Esse agrupamento é incolor, mas ao ser removido, gera uma coloração laranja. A intensidade dessa coloração é medida por espectrofotometria. Existe uma relação entre a absorbância detectada pelos monitores e a quantidade de moléculas de Tritil presentes. Assim, na detritilação, sabemos quantas bases acoplaram devidamente na fase de acoplamento.




Por que meu oligo precisa ser purificado?


Devido a características inerentes do processo de síntese de oligos por adição de fosforamiditas em fase sólida, o produto final da síntese terá, além dos oligos completos, uma porcentagem de sequências truncadas (incompletas). Além dessas sequências truncadas, restos de reagentes, sais e subprodutos da síntese precisam ser removidos. A Exxtend oferece três métodos de purificação a serem solicitados de acordo com as demandas da sua pesquisa: Dessalinização, RP-OPC e HPLC.




Quais são as diferenças entre as formas de purificação?


Dessalinização: A coluna para dessalinização é composta de um gel poroso em que as partículas são separadas com base em seus tamanhos moleculares. Na dessalinização são removidos sais e oligos incompletos pequenos, mas não são removidas as sequências truncadas de tamanho próximo ao do oligo completo. Oligos dessalinizados são utilizados em amplificações simples e sequenciamentos, pois as sequências incompletas não afetarão os resultados.

RP-OPC: O cartucho de purificação de oligonucleotídeos por fase reversa (Reverse-Phase Oligonucleotide Purification Cartridge) consiste em uma coluna preenchida por resina polimérica de alta performance. O método baseia-se na forte ligação entre a resina e agrupamento DMT que é deixado na extremidade 5’ somente do oligo completo, na presença de certos reagentes, permitindo assim a eliminação dos sais e impurezas mais comuns e também das sequências truncadas que não tem o grupo DMT (portanto não têm afinidade pela coluna). Em seguida recolhemos apenas os oligos completos. É similar à purificação HPLC, mas com menor grau de pureza e é indicada para PCR, qPCR, sequenciamento, microarray, blotting e clonagem.

HPLC: A Cromatografia líquida de alta eficiência (High performance liquid chromatography) também baseia-se na afinidade entre oligos completos e a coluna. Entretanto, a HPLC vai ainda além da RP-OPC. O método utiliza um gradiente de concentração do conteúdo hídrico dos reagentes, retirando progressivamente as impurezas de acordo com o quão hidrofóbicas elas são. O processo de purificação é controlado por espectroscopia, assim conseguimos resgatar apenas os oligos completos, livres inclusive de restos de fluoróforos. Indicamos purificação por HPLC para sondas, oligos marcados, oligos longos e para fins que exigem oligos impecavelmente puros.




Qual é a diferença entre HPLC e FPLC?


HPLC (High Performance Liquid Chromatography) e FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) são duas técnicas de cromatografia líquida com a mesma origem e a mesma finalidade: separar moléculas! Diferem no tamanho das moléculas que separam, nos buffers que utilizam e na pressão empregada. A FPLC geralmente é operada em pressões médias (até 5bar), compatíveis com o seu principal uso, a separação de proteínas (embora seja também utilizada para a separação de muitas outras biomoléculas, inclusive oligonucleotídeos). A HPLC geralmente é operada com pressões bem maiores, e é compatível com moléculas tanto grandes quanto pequenas. Esse método é adequado para nossos oligos. A pressão que empregamos varia durante o processo cromatográfico, mas gira em torno de 20bar em nossa rotina.

Em resumo, o nome da cromatografia líquida varia de acordo com várias definições, mas o importante é conhecer muito bem as moléculas a serem separadas, para utilizar buffers e pressão adequados!




O que é escala de síntese?


A escala de síntese, dada em nanomoles (nmol), é a quantidade de material presente no início da síntese, e não a quantidade de produto final. Todas as sintetizadoras de oligos operam dessa forma pelo seguinte motivo: não é possível prever a quantidade final de oligos, pois a mesma depende de fatores intrínsecos ao método de síntese. Além disso, o manuseio do oligo após a síntese (clivagem, desproteção, purificação, checagem de qualidade) também gera pequenas perdas. A Exxtend garante um rendimento mínimo de síntese, quantificado em densidade óptica (D.O.), para que o cliente esteja seguro na hora de fazer o pedido de que terá oligos o suficiente para sua pesquisa.




Por que o rendimento mínimo garantido é especificado em D.O. e não em nmol?


Não é possível garantir um rendimento mínimo em nmol porque a massa em nmol depende do peso molecular do oligo, e cada sequência tem seu próprio peso molecular. No entanto, é possível calcular a massa em nmol a partir dessas informações, da seguinte forma:

1 D.O. = 33 ug = 0.033mg
mg = D.O. x 0.033
nmol = [mg ÷ peso molecular] x 10^6

A D.O. enviada, o peso molecular a massa em nmol dos seus oligos e outras informações serão enviados a você na folha de dados que acompanha os oligos, não se preocupe!




Quantas PCRs conseguirei fazer com meus oligos?


Depende da escala de síntese que você solicitou, e da concentração de trabalho que você utilizará em suas reações. Supondo que você pediu o oligo “exemplo_exxtend” purificado por RP-OPC, na escala de 10nmol. Nosso Lab enviou a você uma D.O.=2,8. A Folha de dados informa que, dado o peso molecular do oligo em questão, estamos enviando 10,4 nmol, e que essa massa deve ser dissolvida em 104µl de TE para que o estoque esteja a 100pmol/µl. Dado que uma PCR convencional geralmente utiliza 0,5 a 1 ul de primers na concentração usual de trabalho (10pmol/µl) para um volume final de reação de 25µl, e assumindo o uso do volume máximo (1µl), seu oligo seria suficiente para aproximadamente 1040 reações.




Quais fluoróforos são compatíveis com o aparelho disponível em meu Laboratório?


Para auxiliar os clientes no desenho de suas sondas e no planejamento de seus experimentos, temos uma tabela com alguns dos principais aparelhos para PCR em tempo real e os fluoróforos compatíveis com cada um deles. Caso você tenha uma sonda já desenhada com fluoróforos que não constam na tabela abaixo, pode nos consultar sobre as possibilidades de substituição de fluoróforos!




O que fazer quando os marcadores utilizados no oligo que quero solicitar não constam no catálogo da Exxtend?


Temos uma grande variedade de marcadores em nosso catálogo, possibilitando a substituição da maior parte dos marcadores indisponíveis. Além disso, buscamos continuamente a ampliação do nosso catálogo, portanto caso você não encontre uma substituição possível, pode entrar em contato conosco e indicar os marcadores que precisa. Faremos o possível para atendê-lo. No entanto, é preciso observar que diferentes marcadores possuem pesos moleculares e propriedades físico-químicas distintas. Logo, ao substituir um marcador, analise se o oligo resultante atende às necessidades da sua pesquisa! Observe abaixo alguns exemplos de fluoróforos substituíveis:




Como posso pedir meus oligos?


O método mais rápido e fácil é através deste site. Clique em "Pedidos e Orçamentos".




Posso encomendar um oligo com bases degeneradas (mistas)?


Sim. Não há nenhum custo adicional para este serviço, sendo que qualquer combinação das bases A, G, C ou T pode ser utilizada. Os seguintes códigos são usados para indicar misturas ou modificações de base:

R = A+G

Y = C+T

M = A+C

K = G+T

S = C+G

W = A+T

B = C+G+T

D = A+G+T

H = A+C+T

V = A+C+G

N = A+C+G+T

I = Inosina




Como faço para ressuspender meus oligos?


Os oligos sintetizados pela Exxtend são enviados secos, pois são altamente estáveis nessa forma. Após receber o oligo, por favor, centrifugue o tubo para ter certeza que algum oligo seco que desgrudou do tubo durante o envio seja retornado ao fundo do tubo. Para ressuspender o oligo utilize solução de tampão TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0). Tris (Tris(hidroximetil)aminometano) é um tampão que mantem constante o pH da solução. O EDTA (Ácido etilenodiaminotetraacético) protege o DNA da digestão por nucleases. Deixe o oligo hidratar por alguns minutos com vórtex intermitente antes da quantificação. É importante notar que a diluição da solução estoque para a concentração de trabalho deve sempre ser feita em água pura livre de DNAses




Como preparar uma solução estoque a 100 µM do meu oligo?


A Exxtend fornece uma folha de especificações dos oligos informando os dados quantitativos em nmoles, unidades de densidade óptica (DO), microgramas (µg) e o peso molecular (PM). Isso permite calcular a solução estoque por qualquer valor de concentração que você preferir. A regra geral estabelece que para qualquer oligo, o número de nmoles x 10 vai dar-lhe a quantidade de solvente, em microlitros, para obter solução de 100 µM (pmol/µL).

[Concentração Molar] x [Volume] = [n° de mol], sendo [1 nmol = 1000 pmol]

Portanto, [Volume em µL] = [nmol] x [1000 pmol / 100 µM (pmol/ µL)] = nmol x 10

A folha de especificações dos oligos também apresenta o volume de diluição em µL, para concentração de 100 pmol/µL (µM). Utilizando esse volume de solução, seu oligo estará suspenso na concentração estoque (100 pmol/µL = 100 µM).

Lembre-se que os oligos devem ser diluídos em solução TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), e que a diluição dos mesmos para a concentração de trabalho (5-10 µM) deve ser feita em água pura livre de DNAses.




Como faço o preparo das soluções de ressuspensão?


Primeiramente, prepare o Tris 1M e o EDTA 0,5M segundo os protocolos abaixo:

- TRIS (Tris(hidroximetil)aminometano) 1M (pH = 8,0) (Volume = 1L)

Tris base: 121,12g

Ajustar pH 8,0 c/ HCl

q.s.p. 1000 ml c/ H2O Milli-Q

- EDTA (Ácido Etilenodiaminotetraacético) 0,5M (pH = 8,0) (Volume = 50ml)

EDTA: 9,305g (PM = 372,22)

Ajustar pH = 8,0 c/ NaOH concentrado

q.s.p. 50 ml c/ H2O Milli-Q

Autoclave as soluções de EDTA e Tris antes de preparar a solução tampão TE 1X.

- Solução Tampão TE 1X [10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM (pH 7,5 - 8,0)] (Volume = 500ml)

5 ml de Tris 1 M

0,1 ml de EDTA 0.5 M

494,9 ml de H2O Milli-Q

Armazene o TE 1X em temperatura ambiente em frasco fechado com tampa e parafilme.




Em meu laboratório utilizamos um protocolo para o preparo de TE ligeiramente diferente do protocolo fornecido. Qual devo seguir?


De fato, recomendamos que os oligos sejam ressuspendidos em TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) e não em TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), que é o utilizado na maioria das reações tamponadas com esse buffer. Isso porque, se por um lado o TE ajuda a manter o pH da solução constante e a prevenir a digestão do oligo por DNAses, por outro lado, o TE pode causar inibição da PCR devido à ação quelante do EDTA, caso esse reagente esteja em alta concentração. Assim chegamos a essa fórmula que irá proteger seus oligos e não irá inibir sua PCR. Cabe lembrar que a diluição da solução estoque para a concentração de trabalho deve sempre ser feita em água pura livre de DNAses.




Por quanto tempo posso guardar o oligo?


O oligo liofilizado é estável à temperatura de -20 °C durante pelo menos 1 ano. O oligo dissolvido em TE (50-100 micromolar [µM]) é estável durante pelo menos 6 meses a -20 °C ou 4 °C. O oligo dissolvido em água é estável por 6 meses a -20 °C na ausência de nucleases. Certifique-se que a água utilizada é de pH neutro para evitar depurinação. Não é recomendado armazenar os oligo em água a 4 °C. Alguns oligos modificados são menos estáveis e devem ser utilizados dentro de 3 meses para um desempenho ideal. Isso se aplica, em especial, para oligos marcados com Quasar. Todos os oligos marcados com corantes devem ser armazenadas no escuro para evitar a fotodegradação. É recomendado evitar múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Não é recomendado guardar oligos diluídos (solução de trabalho a 5-10 µM) mesmo que congelados.




Deixei meus oligos na bancada do laboratório no fim de semana. Eles ainda irão funcionar?


Oligos secos possuem uma enorme estabilidade. Entretanto, os oligos em solução apresentam um prazo de validade mais finito. Para a maioria das situações, os oligos dissolvidos (soluções estoque) ainda devem funcionar bem, mesmo se tiverem permanecido à temperatura ambiente durante alguns dias. Entretanto oligos em concentração de trabalho (5-10 µM) não devem ser utilizados após permanecerem na bancada durante a noite.




Qual a temperatura de anelamento dos primers para PCR?


Um parâmetro importante para os iniciadores é a temperatura de anelamento (Tm = melting temperature). As temperaturas de anelamento razoáveis variam entre 55 °C a 70 °C. As temperaturas de calcinação estão, em média, cerca de 5 °C abaixo da Tm dos primers. Como a maioria das fórmulas fornecem um valor Tm estimada, a temperatura de anelamento é apenas um ponto de partida. Portanto, o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Se o experimento não produzir resultados esperados, recomenda-se testar um gradiente de temperatura. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 56°C, 58°C, 60°C, 62°C e 64°C para encontrar a temperatura ideal.




Minha folha de dados apresenta duas Temperaturas de Anelamento. Qual devo usar?


Existem diversos métodos para se calcular a Temperatura de Anelamento. Os valores fornecidos em nossa folha de dados são calculados pelos softwares de nossas sintetizadoras. A primeira forma apresentada é a chamada regra de conteúdo de GC. É um método para oligos curtos (20-25 bases). A segunda forma de calcular o Tm parece ser o método mais preciso e mais indicado para oligos mais longos. Contudo, cabe ressaltar que as fórmulas fornecem apenas uma estimativa da temperatura de anelamento, e o valor de Tm deve ser usado apenas como referência. Quando for utilizar um primer pela primeira vez, teste um gradiente de temperaturas. Por exemplo, se a Tm indicada na sua folha de dados é 60°C, faça a PCR testando as temperaturas 56°C, 58°C, 60°C, 62°C e 64°C para encontrar a temperatura ideal.

Você pode ler mais a respeito e fazer seu próprio cálculo de Tm no seguinte link:

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html




Minha folha de dados apresenta informações para diluição do oligo na concentração de 100pmol/µl, porém os protocolos do meu laboratório utilizam uM. Como faço a conversão?


Não se preocupe, essa conversão é bem simples:

1 pmol/µL = 1 µM;

1 µM = 1 pmol/µL




Estou observando amplificação do controle negativo! Meus primers estão contaminados?


Talvez. Qual é o tamanho da banda amplificada no controle negativo? Tem o tamanho da banda amplificada no template, ou outro tamanho? Você mediu a concentração do primer antes de montar a reação? Se a concentração de primers na reação estiver muito alta, eles podem formar dímeros. Reduza a concentração dos primers na reação e repita a PCR. Caso a banda persista, se ela for do mesmo tamanho que a banda amplificada no template, é possível que haja contaminação. Para evitar contaminações, siga nossas recomendações:

  • Esteja de luvas limpas e use apenas ponteiras, tubos e reagentes autoclavados ao manipular oligos;
  • Dissolva oligos e sondas em TE 1X [10 mM TrisHCl, EDTA 0,1 mM (pH 7,5 - 8,0)], e as diluições das soluções de trabalho em água nuclease-free;
  • Faça alíquotas pequenas, de acordo com a sua demanda, de forma que sempre que precisar possa utilizar uma nova alíquota, evitando assim o frequente descongelamento/recongelamento e, principalmente, a contaminação do estoque.




Em minha PCR em tempo real, há amplificação do template, porém também há amplificação do branco. O que está acontecendo?


Em nossa experiência, percebemos que isso geralmente ocorre devido à alguns fatores:

1) Desenho do primer, que pode gerar estruturas secundárias (hairpim, self-dimer, hetero-dimer), decorrentes da interação entre os primers. Essas estruturas vão se formando a cada ciclo, similar à amplificação do template e são bem pequenas, por isso não aparecem no gel. Isso pode ser evitado com um desenho cuidadoso dos primers e posterior análise individual dos primers, e em conjunto, em analisadores de oligos online. Verifique também a especificidade dos primers e possíveis off-targets.

2) Alta concentração dos primers, isso também favorece a formação de estruturas secundárias. Por isso, recomendamos que sempre que for fazer uma PCR com primers novos, realize um gradiente de concentração pela temperatura para avaliar a eficiência de reação dos primers. Para isso, utilize um "pool" do DNA (template) que será usado para a reação (em torno de 20 ng para DNA genômico) e alterne a temperatura (de 58°C, 60°C, 62°C e 64°C) e concentração dos primers de (1µM, 0.5µM, 0.25µM, 0.125µM e 0.0625µM).

3) Primer mal sintetizado e/ou purificado, isso também pode ocorrer, embora seja um pouco mais raro que os itens acima.

Se na sua PCR há amplificação do produto (amplicon), é provável que esteja ocorrendo a formação de estruturas secundárias. Na literatura existem relatos de aditivos que podem ser utilizados na PCR para aumentar a especificidade e diminuir a formação de estruturas secundárias. Nesse caso seria interessante diminuir a quantidade de primer na PCR, aumentar a temperatura de anelamento da PCR, ou utilizar DMSO entre 3% e 7%. O DMSO deve ser adicionado diretamente na reação da PCR, portanto, se o volume final da reação é de 25µL, ao adicionar 0,75µL de DMSO (para ter a concentração de 3%), esse volume deve ser descontado do volume de água adicionado para completar 25µL.

Com essas medidas deve haver aumento da especificidade do primer, aumentando consequentemente a quantidade de templates utilizados e diminuindo a formação dessas estruturas secundárias. Caso essas medidas não sejam suficientes, os primers devem ser redesenhados.





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