Os oligonucleotídeos, ou simplesmente oligos, são componentes essenciais para a biologia molecular. Utilizados em diversas aplicações, eles formam a base para o sucesso de técnicas como a PCR e o sequenciamento de DNA. A precisão em sua síntese é crucial, e qualquer erro pode comprometer o resultado de um experimento.
Neste guia completo, aprofundamos no processo detalhado da produção de oligos, do primeiro passo até a entrega final, explicando a Ciência por trás de uma síntese de alta qualidade.
O que são Oligonucleotídeos?
O termo "oligos" na biologia molecular é uma abreviação de oligonucleotídeos, que são pequenas sequências de nucleotídeos, os blocos de construção do DNA. Eles geralmente contêm cerca de 20 bases, mas, na Exxtend, podem ser sintetizados com até 199 bases para aplicações específicas.
Nucleotídeos são compostos por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupo fosfato. Quando se juntam, formam as longas cadeias que constituem o material genético de todos os seres vivos.
Os oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório, geralmente em fita simples. Existem diversos tipos, cada um com uma funcionalidade específica na pesquisa:
- Primers: Sequências curtas e simples de DNA, com as bases comuns A, C, G e T. São usados para iniciar a replicação do DNA, especialmente em PCR convencional.
- Bases Mistas: Oligos que contêm posições com múltiplas possibilidades de nucleotídeos, permitindo a criação de sequências que podem se ligar a várias sequências de DNA. Essas bases degeneradas são representadas por letras específicas como N (A, T, C, G), R (A, G), entre outras.
- Oligos Modificados: Oligonucleotídeos que possuem modificações químicas internas para aumentar a estabilidade, melhorar a afinidade de ligação ou introduzir funcionalidades específicas.
- Oligos Marcados: Oligos que têm moléculas fluorescentes, radioativas ou outras etiquetas químicas ligadas a eles para permitir a detecção e quantificação em várias aplicações.
- Sondas: Sequências de oligonucleotídeos marcadas nas duas extremidades (um fluoróforo na 5’ e um quencher na 3’), usadas para detectar a presença de sequências específicas de ácidos nucleicos por hibridização.
O passo a passo do processo de Síntese de Oligos
A síntese de oligonucleotídeos não é um processo biológico, mas uma reação química automatizada, realizada em um equipamento chamado sintetizador de DNA. O processo funciona como uma linha de montagem molecular, adicionando um nucleotídeo por vez, seguindo a sequência exata desejada.
1. Detritilação Inicial
O processo começa com o desbloqueio do suporte sólido CPG, onde o grupo protetor DMT é removido. Essa etapa ativa o nucleotídeo, deixando a cadeia pronta para o acoplamento da próxima base.
2. Acoplamento
Nesta etapa, o próximo nucleotídeo ativado se liga ao grupo OH livre da base anterior. No caso do primeiro nucleotídeo, ele se liga ao grupo livre da CPG. Esse processo de acoplamento é o que constrói a cadeia dos oligonucleotídeos, adicionando um nucleotídeo de cada vez, na ordem correta da sequência.
3. Bloqueio (Capping)
Em qualquer reação química, podem ocorrer pequenas falhas. Caso a base não tenha se acoplado devidamente, a hidroxila da cadeia que não reagiu é bloqueada por acetilação. Esse bloqueio a torna inerte para reações subsequentes, evitando que a cadeia continue a ser sintetizada com erros. Ou seja, sem esse passo, uma cadeia que deveria ser, por exemplo, AACGT poderia ficar AAGT, se a base C não tivesse se acoplado devidamente.
4. Oxidação
A ligação entre os nucleotídeos recém-formada é estabilizada por meio de um processo de oxidação. Esta etapa é fundamental para estabilizar o grupo fosfato, garantindo a integridade da cadeia de oligonucleotídeos e fortalecendo a ligação fosfodiéster.
5. Detritilação
Após cada adição de nucleotídeo, o grupo protetor DMT é removido novamente. Esta etapa prepara a cadeia para o próximo ciclo de acoplamento, permitindo a adição de mais uma base à sequência.
Esse ciclo é repetido de acordo com a quantidade de bases. Então, se o seu oligo possui 25 bases, esse ciclo será feito 25 vezes.
Etapas após a Síntese do Oligonucleotídeo
Uma vez que a sequência completa de oligos é sintetizada, o processo sai da sintetizadora para as etapas finais que garantem a qualidade e a funcionalidade do produto.
1. Clivagem e Desproteção
Uma vez que a sequência completa de oligos é sintetizada, um processo com uma solução e temperatura específicas quebra as ligações entre o oligonucleotídeo e o suporte, além de remover todos os grupos de proteção das moléculas. Isso permite que o oligo seja preparado para uso posterior.
2. Purificação
O oligo final passa por uma etapa de purificação para remover oligos truncados (cadeias incompletas), impurezas e outros produtos não desejados, garantindo a alta qualidade do produto. As purificações disponíveis são: dessalinização, RP-OPC e HPLC, cada uma indicada para diferentes tipos de oligos e aplicações.
Além do processo de síntese minuciosamente controlado em sistema fechado, a Exxtend conta com um segundo processo de checagem para garantir a qualidade dos oligos por meio de leitura de D.O. (Densidade óptica) em Nanodrop.
4. Secagem para envio
Depois de serem aprovados no Controle de Qualidade, o oligo passa pela etapa de secagem, pois essa é a forma como enviamos os oligos aqui na Exxtend, por ser uma forma altamente estável.
A Exxtend
Na Exxtend, entendemos a importância da qualidade desde o design até a síntese, por isso somos especialistas em síntese de primers e sondas de DNA. Nosso compromisso é fornecer oligonucleotídeos de alta qualidade que garantam a precisão e a confiabilidade dos seus resultados.
A síntese de oligonucleotídeos é um processo que exige precisão em cada etapa. Entender esse processo é fundamental para entender a importância de um fornecedor confiável, cuja expertise garante a qualidade e a integridade da sua matéria-prima.
