Se você trabalha com acoplamento de oligonucleotídeos a superfícies sólidas ou nanopartículas, como as de ouro, é provável que já tenha se deparado com a necessidade de usar oligos tiolados. Mas você sabia que, ao receber esse tipo de oligo, ele ainda não está pronto para uso?
Neste artigo, vamos explicar o que são os oligos tiolados, por que eles são entregues em sua forma inativa e como realizar corretamente o processo de redução para liberar a sulfidrila reativa.
O que são oligonucleotídeos tiolados?
Os oligos tiolados são oligonucleotídeos modificados com um grupo funcional tiol (-SH), normalmente utilizado para aplicações que envolvem imobilização em superfícies ou conjugação com outras biomoléculas. A sulfidrila tem uma afinidade especial por metais nobres, como o ouro, sendo amplamente empregada, por exemplo, na construção de biossensores e nanodispositivos.
No entanto, esses oligonucleotídeos não são enviados na forma ativa. Para garantir sua estabilidade durante o transporte e armazenamento, os grupos tiol são protegidos por meio de ligações dissulfeto (–S–S–). Assim, para que o oligo se torne funcional e a sulfidrila fique livre para interações químicas, é necessário realizar um processo de redução dessas ligações.
Por que reduzir os oligos tiolados?
Durante a síntese, o grupo tiol é protegido para evitar reações indesejadas. A proteção por ligação dissulfeto é eficaz, mas precisa ser desfeita antes do uso, liberando o grupo –SH em sua forma reativa. Essa etapa é essencial para qualquer aplicação em que o oligo precise se ligar a superfícies metálicas ou ser funcionalizado com outras moléculas.
Como realizar a redução de oligos tiolados: passo a passo
1. Preparando o oligo
Se o oligo estiver em solução, recomendamos secá-lo antes da redução — você pode usar um concentrador rotativo ou liofilizador. Isso facilita o controle do volume e da concentração na próxima etapa.
2. Preparando a solução redutora
- Prepare uma solução 100 mM de DTT (ditiotreitol) em TEAA 1 M, com pH entre 8,3 e 8,5.
- Para isso, dissolva 15,5 mg de DTT em 1 mL de TEAA 1 M.
- Lembre-se: o DTT é instável em solução, então prepare apenas o que for usar no momento.
3. Reduzindo o oligo
- Dissolva o oligo seco em 1 mL da solução de DTT preparada.
- Incube à temperatura ambiente por 1 hora. Esse tempo é suficiente para quebrar as ligações dissulfeto e liberar a sulfidrila.
4. Purificando o oligo reduzido
Depois da redução, é essencial remover os subprodutos, principalmente o DTT, que pode interferir nas reações posteriores.
Uma opção prática é utilizar colunas com Sephadex® (como as NAP-10):
- Equilibre a coluna com água ultrapura.
- Aplique o oligo reduzido.
- Adicione 350 µL de água e recolha apenas 1 mL da fração eluída, que conterá o oligo purificado.
5. Quantificando e reconstituindo
Como toda purificação gera perdas, você precisará fazer uma nova leitura para ajustar a concentração:
- Faça a leitura da densidade óptica a 260 nm (ssDNA).
- Com base na massa obtida, utilize o peso molecular do oligo (informado na folha de dados) para calcular a quantidade em nmol.
Fórmula:
nmol = (massa em µg / peso molecular) x 1000
Para preparar uma solução 100 µM:
Volume (µL) = nmol x 10
Exemplo: se restaram 5 nmol, adicione 50 µL do tampão de ressuspensão.
Dica importante: o oligo pode oxidar novamente
Mesmo após a redução, a sulfidrila pode se oxidar com o tempo. Por isso, recomendamos:
- Armazenar o oligo reduzido em alíquotas.
- Manter a -20°C.
- Evitar exposição prolongada ao ar e à luz.
Se perceber perda de funcionalidade, você pode repetir o processo de redução.
A redução correta de oligos tiolados é um passo essencial para garantir sua funcionalidade nas aplicações. Seguindo as instruções adequadas, você assegura o desempenho do seu oligo e o sucesso da sua pesquisa.
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