Se você trabalha com PCR em Tempo Real (qPCR) utilizando sondas de hidrólise (como as populares sondas TaqMan®), já deve ter passado por este cenário: ao desenhar seu ensaio ou tentar importar um protocolo da literatura, você percebe que o fluoróforo recomendado não está disponível para síntese comercial, possui um custo muito elevado ou não consta na tabela padrão do seu fornecedor.
A boa notícia é que você não precisa refazer o desenho dos seus primers ou mudar de metodologia. Na maioria dos casos, é perfeitamente possível realizar a substituição do fluoróforo da sonda por uma molécula equivalente, mantendo a mesma eficiência de leitura no termociclador e economizando reagentes.
Neste artigo, vamos explicar por que algumas moléculas são restritas, o que avaliar antes de fazer a troca e disponibilizar uma tabela completa de substituição de fluoróforos para o seu laboratório.
Por que alguns fluoróforos não estão disponíveis para síntese?
Muitos pesquisadores se perguntam por que nem todas as marcações do mercado são oferecidas de forma direta no formulário de pedido de oligonucleotídeos. Existem dois motivos principais para isso:
- Patentes e restrições comerciais: Vários fluoróforos comerciais amplamente citados em artigos científicos antigos são moléculas patenteadas por marcas específicas. Isso impede a comercialização e síntese direta por outros fabricantes.
- Custo-Benefício e baixa procura: Determinadas moléculas possuem uma demanda global muito baixa ou processos de acoplamento sintético extremamente caros, o que encarece o produto final sem trazer ganho real de fluorescência.
Para contornar essas limitações, a indústria de síntese de oligonucleotídeos desenvolveu fluoróforos equivalentes: moléculas que possuem propriedades espectrais (comprimento de onda de excitação e emissão) praticamente idênticas às das marcas registradas.
O que avaliar antes de substituir o fluoróforo da sua sonda?
Antes de selecionar uma molécula substituta para o seu experimento de qPCR, é fundamental validar dois critérios técnicos na bancada:
Canais de Leitura do Termociclador
O fator mais crítico não é o nome comercial da molécula, mas sim o canal de detecção do seu equipamento. Diferentes fluoróforos funcionam sob o mesmo comprimento de onda. Por exemplo: o FAM e o FITC são lidos no mesmo canal (Filtro Azul / ~495 nm excitação e ~520 nm emissão).
Antes de encomendar, consulte o manual do seu termociclador e verifique se os filtros de emissão/excitação estão calibrados para aquele canal.
Escolha do Quencher Compatível
O quencher é a molécula situada na extremidade 3’ da sonda responsável por absorver a fluorescência do fluoróforo (situado na extremidade 5’) até que ocorra a clivagem pela DNA polimerase.
- Fluoróforos do espectro verde/amarelo (como FAM, HEX, TET, JOE) combinam perfeitamente com o quencher BHQ 1.
- Fluoróforos do espectro Laranja/Vermelho (como ROX, Texas Red, Cy5) exigem o uso do quencher BHQ 2.
Como fazer o pedido da sua sonda personalizada na Exxtend?
Na Exxtend, oferecemos uma ampla variedade de marcações 5’ e 3’ para atender com precisão e economia os seus projetos de pesquisa e diagnóstico molecular.
Se você está padronizando um novo ensaio ou precisa adaptar um protocolo existente com uma marcação alternativa:
1 - Acesse o nosso formulário de pedidos no site www.exxtend.com.br.
2 - Insira a sequência da sua sonda e selecione o fluoróforo equivalente desejado (como FAM, HEX, etc.).
3 - Caso precise de uma marcação especial não listada no formulário padrão, entre em contato direto com nossa equipe.
